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鑑別細胞週期蛋白依賴性激酶1(CDK1)為致癌性淋巴細胞特異性蛋白酪氨酸激酶(Lck)的潛在磷酸化標的物

為了解決perpetuating中文的問題，作者陳思元 這樣論述：

目錄中文摘要………………………………………………………………i英文摘要…………………………………………………………………ii目錄……………………………………………………………………iii圖目錄…………………………………………………………………viii表目錄……………………………………………………………………x附錄目錄………………………………………………………………xi第一章 緒論……………………………………………………………11.1 蛋白質酪氨酸激酶 (Protein tyrosine kinases,PTKs)…………11.2 淋巴細胞特異性蛋白酪氨酸激酶 (Lymphocyte-spec

ificprotein tyrosine kinase,Lck)…………………………………31.3 PTKs在細胞內的運輸 (Intracellular trafficking)……………51.4 蛋白質體學 (Proteomics)………………………………………61.5 細胞週期蛋白依賴性激酶1 (Cyclin-dependent kinase 1)………81.6 研究動機與目的…………………………………………………12第二章 研究材料與方法………………………………………………132.1 抗體 (Antibody)………………………………………………132.2 細胞株 (Cell Line)

……………………………………………142.3 建構穩定細胞株(Stable Cell Line)…………………………142.3.1 Lck基因………………………………………………………142.3.2 質體轉染 (Transfection)…………………………………152.3.2.1 磷酸鈣-DNA共沉澱法 (Calcium phosphate-DNAcoprecipitation)………………………………………152.3.2.2 Neon電穿孔轉染系統 (Neon ElectroporationSystem)………………………………………………162.3.3 篩選穩定表達外源基因細胞株…………

…………………172.4 細胞培養 (Cell culture)……………………………………172.5 細胞分餾 (Cell fractionation)……………………………182.6 萃取蛋白質 (Protein extraction)…………………………202.6.1 萃取細胞蛋白質……………………………………………202.6.2 萃取粒線體蛋白質…………………………………………212.7 蛋白質定量 (Protein quantification)……………………212.8 SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳 (SDS-PAGE)……………………222.8.1 配置膠體…………………………………

…………………222.8.2 配置蛋白質樣品……………………………………………232.8.3 凝膠電泳……………………………………………………232.9 西方墨點法 (Western blot)…………………………………242.9.1 蛋白質轉印…………………………………………………242.9.2 免疫墨點法…………………………………………………252.10 抗體去除………………………………………………………252.11 磷酸蛋白質體學實驗 (Phosphoproteomics)………………262.11.1 溶液中蛋白質水解 ………………………………………262.11.2 脫鹽 …………………

……………………………………262.11.3 富集磷酸化胜肽片段 ……………………………………272.11.4 富集酪氨酸磷酸化胜肽片段 ……………………………292.11.4.1 4G10免疫沉澱…………………………………………292.11.4.2 鹼處理 …………………………………………………302.11.5 一維液相層析串聯式質譜分析(1D LC-MS/MS)………302.12 電子傳遞鏈複合物I活性實驗分析 (Electron transportchain complex I activity assay)………………………………312.13 細胞氧氣消耗分析(Oxygen consu

mption)…………………322.14 銀染實驗(Silver staining)……………………………………342.15 代謝體學實驗(Metabolomics experiment)…………………362.16 統計方法………………………………………………………36第三章 實驗結果………………………………………………………383.1 利用磷酸蛋白質體學尋找在白血病細胞粒線體中潛在的Lck標的蛋白質………………………………………………………383.1.1 建立專一性表達粒線體Lck的細胞株……………………383.1.1.1 利用限制酶切割確認可以專一性表達粒線體Lck的質體之正確性……………

…………………………………383.1.1.2 利用基因定序確認專一性表達粒線體Lck質體的Mitotarget序列之正確性…………………………………393.1.1.3 利用細胞分餾實驗及西方墨點法確認Lck是否專一性表達於粒線體中…………………………………………403.1.2 選定使用在磷酸蛋白質體學的白血病細胞……………413.1.2.1 鑑定小鼠白血病細胞LSTRA、EL4在粒線體中活化態Lck及酪氨酸磷酸化蛋白質的表達水平……………413.1.2.2 鑑定LSTRA粒線體功能下降與活化Lck的關係……423.1.3 對磷酸蛋白質體學中使用的樣品進行品質管控…………443.1.4 利用磷酸

蛋白質體學找尋在白血病細胞粒腺體內被Lck磷酸化的潛在標的蛋白質……………………………………443.2 鑑定Lck與CDK1的調控關係及對粒線體功能的影響……463.2.1 利用細胞分餾實驗及西方墨點法觀察在LSTRA及EL4細胞中Lck與CDK1的調控關係………………………………473.2.2 探討在EL4細胞中表達突變型Y505F Lck對CDK1………483.2.2.1 建立表達外源性Y505F Lck的EL4細胞……………483.2.2.2 利用細胞分餾實驗及西方墨點法觀察表達突變型Y505FLck的EL4細胞與正常表型EL4細胞中Lck與CDK1的調控關係……………………………………

……493.2.3 分析EL4/Vector及EL4/Y505F- Lck兩細胞之電子傳遞鏈複合物I 功能…………………………………………………503.2.4 對LSTRA、EL4/Vector及EL4/Y505F-Lck細胞進行氧氣消耗分析……………………………………………513.2.5 探討Lck活性受到抑制後CDK1的變化…………523.2.5.1 Lck抑制劑處理LSTRA細胞……………………………523.2.5.2 利用細胞分餾實驗及西方墨點法觀察經過Lck抑制劑處理的LSTRA細胞中Lck與CDK1的調控關係……53第四章 討論……………………………………………………………54第五

章 結論……………………………………………………………60參考文獻 ………………………………………………………………61圖表 ……………………………………………………………………73附圖……………………………………………………………………112圖目錄圖一、 確認質體之正確性……………………………………………73圖二、 利用基因定序確認專一性表達粒線體Lck質體中Mito target序列之正確性…………………………………………………75圖三、 確認將專一性表達粒線體蛋白質質體轉染的HEK293細胞，在各胞器部分表達Lck的情形………………………………76圖四、 確認白血病細株LSTRA、EL4

、Jurkat、JCam活化態Lck及Lck的表達……………………………………………………78圖五、 確認白血病細胞株在粒線體及細胞質酪氨酸磷酸化蛋白質表達差異……………………………………………………80圖六、 對EL4和LSTRA的細胞氧氣消耗分析……………………81圖七、 蛋白質體學樣品分析及品質管控……………………………82圖八、 磷酸化蛋白質體學實驗流程…………………………………84圖九、 以銀染實驗確認蛋白質樣品水解為胺基酸…………………85圖十、 兩項富集酪氨酸磷酸化胜肽片段實驗方法，使用4G10抗體免疫沉澱及使用NaOH鹼處理………………………………86圖十一、 對比在LSTRA

、EL4兩細胞中pCDK1 Y15磷酸化比例及CDK1在各胞器中表達量……………………………………88圖十二、 確認線性化質體DNA………………………………………91圖十三、 確認在EL4細胞使用Neon電穿孔轉染實驗條件………92圖十四、 確認Lck穩定轉染EL4細胞表達Lck蛋白質情形………93圖十五、 對比在EL4/Vector及EL4/Y505F-Lck兩細胞中pCDK1Y15磷酸化比例及CDK1在各胞器中表達量…………94圖十六、 分析EL4/Vector及EL4/Y505F-Lck 兩細胞之電子傳遞鏈Lck兩細胞之粒線體複合物I功能活性…………………97圖十七、 對LSTRA、EL

4/Vector及EL4/Y505F-Lck之細胞氧氣消耗分析……………………………………………………99圖十八、 確認使用不同濃度Lck抑制劑處理LSTRA細胞後抑制Lck在Y394磷酸化的結果……………………………………100圖十九、 進一步確認Lck抑制劑處理在LSTRA細胞中抑制Lck磷酸化的效果及專一性……………………………………102圖二十、 對比在LSTRA及經過Lck抑制劑處理的LSTRA兩細胞中pCDK1 Y15磷酸化比例及CDK1在各胞器中表達量…104圖二十一、 Lck通過CDK1導致粒線體功能下降的潛在機制……105表目錄表一、 LSTRA細胞粒線體萃取物利用蛋白質體學

在經過TiO2純化磷酸化胜肽片段再進行免疫沉澱後由4G10抗體抓取之酪氨酸磷酸化胜肽片段及所屬蛋白質身份……………………106表二、 LSTRA細胞粒線體萃取物利用蛋白質體學在經過TiO2純化磷酸化胜肽片段再進行免疫沉澱後未被4G10抗體抓取之酪氨酸磷酸化胜肽片段及所屬蛋白質身份…………………107表三、 LSTRA細胞粒線體萃取物利用蛋白質體學在經過TiO2純化磷酸化胜肽片段再進行NaOH鹼處理匯集的酪氨酸磷酸化胜肽片段及所屬蛋白質身份…………………………………109表四、 EL4細胞粒線體萃取物利用蛋白質體學在經過TiO2純化磷酸化胜肽片段再進行NaOH鹼處理匯集的酪氨酸磷酸化胜肽片段及所

屬蛋白質身份…………………………………………111 附圖目錄附圖一、 在Jurkat粒線體中Lck導致粒線體功能下降的潛在機制…………………………………………………………112附圖二、 利用代謝體學實驗分析LSTRA及EL4細胞中糖解作用(Glycolysis)及三羧酸循環(TCA cycle)的中間產物…114附圖三、 利用代謝體學實驗結果分析出LSTRA及EL4細胞產生ATP的比值……………………………………………………115附圖四、 細胞週期蛋白B1/CDK1與粒線體的調控………………116

職場無禮與員工身心健康：反芻反應雙概念模式之中介效果探討

為了解決perpetuating中文的問題，作者廖品筑 這樣論述：

　　反芻反應被證實與個人的身心狀態存在關聯性，並且反芻反應根據其內涵可以區分為兩種不同的類型：苦惱自責與深思反省。本研究企圖在職場脈絡下，探討不同類型的反芻反應，對於職場無禮與員工之身心健康間的中介效果與差異。　　本研究採取立意抽樣法，以目前正在台灣組織中就業的成年人為研究對象，總共收集正式的有效問卷共658份。研究工具為「中文版反應風格量表修訂短版」、「知覺職場無禮量表改版」、「職業壓力指標測驗」中的「心理健康量表」與「生理健康量表」。　　研究結果如下：一，職場無禮對員工的身心健康具有負向的預測效果；二，職場無禮對於反芻反應具有正向的預測效果；三，「苦惱自責」與「深思反省」都可以負向預測員

工的心理與生理健康；四，職場無禮會透過「反芻反應」的雙中介變項負向影響員工的心理健康與生理健康。在心理健康的中介效果上，「苦惱自責」比「深思反省」具有更強的負面中介效果；在生理健康的中介效果上，則是「深思反省」比「苦惱自責」具有更強的負面中介效果。透過本研究結果，增補了不同類型反芻反應的效果與作用差異，研究者亦根據研究結論提出在未來研究方向、組織實務與諮商實務上的建議。