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美羅培南導致綠膿桿菌死亡的比較蛋白質體學研究

為了解決Mac 即時 轉錄的問題，作者王怡婷 這樣論述：

誌謝-------------------------------------------------------------------------------------¬¬--i中文摘要-------------------------------------------------------------------------------iii英文摘要--------------------------------------------------------------------------------v目錄----------------------------------

---------------------------------------------------vii表目錄----------------------------------------------------------------------------------xii圖目錄---------------------------------------------------------------------------------xiii名詞縮寫說明----------------------------------------------------------------

---------xv第一章 緒論----------------------------------------------------------------------------1第一節 綠膿桿菌概述-----------------------------------------------------------2一、 綠膿桿菌特性簡介-----------------------------------------------------2二、 綠膿桿菌傳統生化培養-----------------------------------------------3三、 綠膿

桿菌基因體--------------------------------------------------------3四、 綠膿桿菌之臨床感染--------------------------------------------------4五、 綠膿桿菌感染盛行率--------------------------------------------------4第二節 綠膿桿菌治療-----------------------------------------------------------6一、 綠膿桿菌治療概述---------------------------

--------------------------6二、 經驗性抗生素治療-----------------------------------------------------7三、 臨床藥敏試驗與標的治療--------------------------------------------8四、 綠膿桿菌抗美羅培南機制--------------------------------------------9五、 新型治療---------------------------------------------------------------10第三節 藥物對細菌蛋白質體

影響的研究---------------------------------11第四節 研究動機與目的------------------------------------------------------12第五節 研究流程圖------------------------------------------------------------13第二章 材料與方法-----------------------------------------------------------------14第一節 實驗材料與設備-------------------------------

-----------------------14一、 菌株---------------------------------------------------------------------14二、 培養基成分------------------------------------------------------------14三、 實驗藥品及試劑------------------------------------------------------15(一) 抗微生物藥劑-------------------------------------------------

---15(二) 蛋白質體學-------------------------------------------------------151. 蛋白質萃取之藥品----------------------------------------152. 定量試劑----------------------------------------------------163. 蛋白質電泳之藥品----------------------------------------164. 膠體內蛋白水解之藥品----------------------------------185. 液相層析

串聯質譜儀之藥品----------------------------19(三) 反轉錄暨即時定量聚合酶連鎖反應之藥品----------------191. RNA萃取之藥品------------------------------------------192. 反轉錄作用之藥品----------------------------------------193. 即時定量聚合酶連鎖反應之藥品----------------------19四、 實驗儀器-------------------------------------------------------------

--19(一) 一般實驗儀器----------------------------------------------------20(二) 蛋白質體學-------------------------------------------------------201. 一維電泳----------------------------------------------------202. 二維電泳----------------------------------------------------203. 影像分析設備------------------------------

----------------204. 液相層析串聯質譜儀分析設備-------------------------21(三) 反轉錄暨即時定量聚合酶連鎖反應設備-------------------21第二節 實驗方法---------------------------------------------------------------22一、 細菌培養---------------------------------------------------------------22二、 殺菌試驗----------------------------------------

-----------------------22三、 菌落計數---------------------------------------------------------------23四、 蛋白質體學------------------------------------------------------------23(一) 一維電泳----------------------------------------------------------231. 蛋白質萃取--------------------------------------------------232

. 一維電泳-----------------------------------------------------23(二) 二維電泳----------------------------------------------------------251. 蛋白質萃取--------------------------------------------------252. 蛋白質定量--------------------------------------------------263. 等電點聚電焦電泳(IEF) -----------------------------

-----264. 平衡 (Equilibration)----------------------------------------275. 二維電泳-----------------------------------------------------28(三) 影像分析----------------------------------------------------------29(四) 蛋白質體分析----------------------------------------------------291. 膠體內蛋白水解---------------------

-----------------------292. 液相層析串聯質譜儀--------------------------------------303. MASCOT search--------------------------------------------31五、 反轉錄暨即時定量聚合酶連鎖反應分析------------------------31(一) RNA萃取---------------------------------------------------------31(二) 反轉錄作用---------------------------------

----------------------32(三) 引子設計與合成-------------------------------------------------32(四) 即時定量聚合酶連鎖反應-------------------------------------33六、 數據統計分析---------------------------------------------------------34第三章 研究結果--------------------------------------------------------------------35第一節 美羅培南對

綠膿桿菌之殺菌濃度---------------------------------35第二節 美羅培南對綠膿桿菌之殺菌時間---------------------------------37第三節 綠膿桿菌死亡過程中蛋白質變化---------------------------------38第四節 相關蛋白質資訊分析------------------------------------------------40第五節 美羅培南誘發綠膿桿菌基因的表現------------------------------44第四章 討論與結論----------------------

-------------------------------------------50第一節 美羅培南對綠膿桿菌之時間殺菌曲線---------------------------51第二節 綠膿桿菌生長代謝的蛋白質變化---------------------------------52第三節 細菌死亡過程中變化的蛋白質與基因調控---------------------54第四節 結論---------------------------------------------------------------------55參考文獻-----------------------

--------------------------------------------------------57附錄-----------------------------------------------------------------------------------103附錄一. 綠膿桿菌PAO1基因體-------------------------------------------103附錄二. Pseudomonas aeruginosa ATCC®27853TM經各濃度美羅培南處理1小時之蛋白質一維電泳---------------------------

------104附錄三. 臨床分離抗藥性綠膿桿菌經各濃度美羅培南處理1小時之蛋白質一維電泳---------------------------------------------------105附錄四. KEGG分析補充資料---------------------------------------------106附錄五. 研討會壁報發表---------------------------------------------------116表目錄表一、 綠膿桿菌各種基因序列資訊--------------------------------------------6

3表二、 綠膿桿菌各種基因引子序列--------------------------------------------64表三、 綠膿桿菌經美羅培南處理1小時之蛋白質鑑定結果--------------65表四、 綠膿桿菌經美羅培南處理之蛋白質二維電泳分析與mRNA表現---------------------------------------------------------------------------------------66圖目錄圖一、 美羅培南對綠膿桿菌之殺菌試驗--------------------------------------67圖二、 美羅培南

(64 μg/mL)對Pseudomonas aeruginosa ATCC®27853TM的時間殺菌曲線--------------------------------------------------------------------69圖三、 Pseudomonas aeruginosa ATCC®27853TM經美羅培南處理1小時之蛋白質一維電泳--------------------------------------------------------------70圖四、 Pseudomonas aeruginosa ATCC®27853TM經美羅培南處理1小時之蛋白質二

維電泳--------------------------------------------------------------71圖五、 Electron transfer flavoprotein-ubiquinone oxidoreductase的鑑定--72圖六、 60 kDa chaperonin的鑑定------------------------------------------------74圖七、 Dihydrolipoyl dehydrogenase的鑑定-----------------------------------76圖八、 Arginine deim

inase的鑑定-----------------------------------------------78圖九、 Dihydrolipoyllysine-residue succinyltransferase component of 2-oxoglutarate dehydrogenase complex的鑑定------------------------------80圖十、 Leucine-, isoleucine-, valine-, threonine-, and alanine-binding protein的鑑定---------------------------

--------------------------------------------------82圖十一、 Outer membrane protein assembly factor BamB的鑑定---------84圖十二、 A-type flagellin的鑑定-----------------------------------------------86圖十三、 Ornithine carbamoyltransferase, catabolic的鑑定----------------88圖十四、 Acetyl-coenzyme A carboxylase carboxy

l transferase subunit alpha的鑑定--------------------------------------------------------------------90圖十五、 利用Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG)分析各蛋白質所屬的功能類別---------------------------------------------------92圖十六、 60 kDa chaperonin之groEL基因表現----------------------------93圖十七、 Leucine-, i

soleucine-, valine-, threonine-, and alanine-binding protein之braC基因表現-----------------------------------------------------94圖十八、 Outer membrane protein assembly factor BamB之bamB基因表現---------------------------------------------------------------------------------95圖十九、 A-type flagellin之PSPA7_4279基因

表現------------------------96圖二十、 Electron transfer flavoprotein-ubiquinone oxidoreductase之PA2953基因表現---------------------------------------------------------------97圖二十一、 Dihydrolipoyl dehydrogenase之lpdA基因表現-----------------98圖二十二、 Arginine deiminase之arcA基因表現------------------------------99圖二十三、

Dihydrolipoyllysine-residue succinyltransferase component of 2-oxoglutarate dehydrogenase complex之sucB基因表現----------------100圖二十四、 Ornithine carbamoyltransferase, catabolic之arcB基因表現--101圖二十五、 Acetyl-coenzyme A carboxylase carboxyl transferase subunit alpha之accA基因表現--------------------------------

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N-deacetylase/N-sulfotransferase 4表現於大腸直腸癌細胞對巨噬細胞分化和血管新生之調控

為了解決Mac 即時 轉錄的問題，作者陳秀婷 這樣論述：

本實驗室先前利用失異合性 (loss of heterozygosity) 研究，於人類第四號染色體4q26區域篩選出N-deacetylase/N-sulfotransferase (NDST4) 為大腸直腸癌相關之抑癌基因。已知NDST4參與Heparan sulfate proteoglycans (HSPGs) 之生合成過程，而HSPGs在發育、生長和炎症反應、腫瘤發生等不同生理和病理機制皆扮演重要角色。本論文將探討NDST4對於大腸直腸癌腫瘤微環境之巨噬細胞分化和血管新生的調控。首先利用THP-1及U937細胞建立巨噬細胞分化之細胞模型，藉由M0、M1和M2亞型得的細胞形態、標的基

因和細胞表面抗原確認其分化。接續以表現NDST4之大腸直腸癌細胞或其條件培養液與M0細胞共培養，結果顯示：表現NDST4之大腸直腸癌細胞及其條件培養液可促進巨噬細胞分化成M1亞型。此外，利用先前研究之異種移植腫瘤組織切片經CD68染色，結果顯示NDST4表現之大腸直腸癌細胞所形成之腫瘤，其腫瘤周圍巨噬細胞 (tumor-associated macrophage) 的數量較多。另一方面，以不同濃度doxycycline誘導大腸直腸癌細胞表現NDST4，確認NDST4表現會抑制細胞內和分泌至細胞外的促血管新生因子urokinase-type plasminogen activator (uPA

) 的mRNA及蛋白表現。檢測我們收集的51對大腸直腸癌檢體，腫瘤的uPA表現量明顯高於其成對的正常黏膜組織 ; 利用不同來源之大腸直腸癌資料庫分析，顯示預後較差的病患其腫瘤uPA表現量明顯較高，NDST4表現量則明顯較低。最後，藉由人類細胞激素晶片分析，發現誘導表現NDST4之大腸直腸癌細胞的條件培養液，其Serpin E1、macrophage migration inhibitory factor (MIF)、IL-8、CXCL12及CXCL1含量下降。綜合以上，推測大腸直腸癌細胞表現NDST4可能藉由減少上述調節因子，進而影響腫瘤微環境之巨噬細胞分化及血管新生。